Transfektion - Wikipedia

Transfektion ist der Prozess des absichtlichen Einführens von nackten oder gereinigten Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen. ^[1][2] Es kann sich auch auf andere Verfahren und Zelltypen beziehen, obwohl andere Ausdrücke bevorzugt werden: "Transformation" wird üblicherweise dazu verwendet beschreiben den nicht-viralen DNA-Transfer in Bakterien und nicht-tierischen eukaryotischen Zellen, einschließlich Pflanzenzellen. In Tierzellen ist Transfektion der bevorzugte Begriff, da Transformation auch verwendet wird, um das Fortschreiten in einen Krebszustand (Karzinogenese) in diesen Zellen zu bezeichnen. Die Transduktion wird häufig verwendet, um den Virus-vermittelten Gentransfer in eukaryotische Zellen zu beschreiben. ^[2][3]

Das Wort Transfektion ist ein portmanteau von Trans-Infektion und . Genetisches Material (wie supercoiled Plasmid-DNA oder siRNA-Konstrukte) oder sogar Proteine ​​wie Antikörper können transfiziert werden.

Bei der Transfektion von Tierzellen werden typischerweise transiente Poren oder "Löcher" in der Zellmembran geöffnet, um die Aufnahme von Material zu ermöglichen. Die Transfektion kann unter Verwendung von Calciumphosphat (d.h. Tricalciumphosphat), durch Elektroporation, durch Zellquetschen oder durch Mischen eines kationischen Lipids mit dem Material durchgeführt werden, um Liposomen herzustellen, die mit der Zellmembran verschmelzen und ihre Ladung im Inneren ablegen.

Die Transfektion kann zu unerwarteten Morphologien und Abnormalitäten in Zielzellen führen.

Terminologie [ edit ]

Die Bedeutung des Begriffs hat sich weiterentwickelt. ^[4] Die ursprüngliche Bedeutung der Transfektion war "Infektion durch Transformation", dh Einführung von genetischem Material, DNA oder RNA, von einem Prokaryoten-infizierenden Virus oder Bakteriophagen in Zellen, was zu einer Infektion führt. Da der Begriff der Transformation in der tierischen Zellbiologie einen anderen Sinn hatte (eine genetische Veränderung, die eine langfristige Vermehrung in Kultur oder den Erwerb von für Krebszellen typischen Eigenschaften ermöglicht), erhielt der Begriff Transfektion für tierische Zellen seine derzeitige Bedeutung einer Zellveränderung Eigenschaften durch Einführung von DNA.

Methods [ edit ]

Es gibt verschiedene Methoden, fremde DNA in eine eukaryontische Zelle einzuführen: Einige setzen auf physikalische Behandlung (Elektroporation, Zellpressen, Nanopartikel, Magnetofektion); andere verlassen sich auf chemische Materialien oder biologische Partikel (Viren), die als Träger verwendet werden. Die Genabgabe ist beispielsweise einer der Schritte, die für die Gentherapie und die genetische Modifikation von Pflanzen erforderlich sind. Es gibt viele verschiedene Methoden der Genabgabe, die für verschiedene Arten von Zellen und Geweben von Bakterien bis Säugetieren entwickelt wurden. Im Allgemeinen können die Methoden in zwei Kategorien unterteilt werden: nicht-viral und viral. ^[5]

. Nicht-virale Methoden umfassen physikalische Methoden wie Elektroporation, Mikroinjektion, Genkanone, Impalefektion, hydrostatischer Druck. kontinuierliche Infusion und Beschallung und Chemikalie wie Lipofektion, bei der es sich um einen Lipid-vermittelten DNA-Transfektionsprozess handelt, der Liposomenvektoren verwendet. Es kann auch die Verwendung von polymeren Genträgern (Polyplexen) einschließen. ^[6]

Die durch Viren vermittelte Genabgabe nutzt die Fähigkeit eines Virus, seine DNA in eine Wirtszelle zu injizieren. Ein zur Abgabe vorgesehenes Gen wird in ein virenfreies Partikel mit Replikationsdefizienz verpackt. Bisher verwendete Viren umfassen Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Paramyxovirus ^[7] und Herpes-Simplex-Virus. Es gibt jedoch Nachteile bei der Verwendung von Viren, um Gene in Zellen einzubringen. Viren können nur sehr kleine DNA-Stücke in die Zellen befördern, es ist arbeitsintensiv und es besteht das Risiko von zufälligen Insertionsstellen, zytopathischen Effekten und Mutagenese.

Nichtvirale Methoden [ edit ]

Transfektion auf chemischer Basis [

Transfektion auf chemischer Basis kann unterteilt werden verschiedene Arten: Cyclodextrin, ^[8] Polymere, ^[9] Liposomen oder Nanopartikel ^[10] (mit oder ohne chemische oder virale Funktionalisierung. Siehe unten).

• Eine der billigsten Methoden verwendet Kalziumphosphat das ursprünglich von F.L. Graham und A.J. van der Eb 1973 ^[11] entdeckt wurde (siehe auch ^[12]). HEPES-gepufferte Salzlösung (HeBS), die Phosphationen enthält, wird mit einer Calciumchloridlösung kombiniert, die die zu transfizierende DNA enthält. Wenn die beiden kombiniert werden, bildet sich ein feiner Niederschlag des positiv geladenen Calciums und des negativ geladenen Phosphats und bindet die zu transfizierende DNA an seiner Oberfläche. Die Suspension des Präzipitats wird dann zu den zu transfizierenden Zellen hinzugefügt (üblicherweise eine Zellkultur, die in einer Monoschicht gezüchtet wurde). Durch einen Prozess, der nicht vollständig verstanden wird, nehmen die Zellen einen Teil des Niederschlags und damit die DNA auf. Dieses Verfahren war eine bevorzugte Methode zur Identifizierung vieler Onkogene. ^[13]


• Andere Verfahren verwenden hochverzweigte organische Verbindungen sogenannte Dendrimere, um die DNA zu binden und in die Zelle zu gelangen.


• Eine andere Methode ist die Verwendung von kationischen Polymeren wie DEAE-Dextran oder Polyethylenimin (PEI). Die negativ geladene DNA bindet an das Polykation und der Komplex wird durch Endozytose in die Zelle aufgenommen.


• Lipofection (oder Liposomentransfektion) ist eine Technik, mit der genetisches Material mittels Liposomen in eine Zelle injiziert wird Dies sind Vesikel, die leicht mit der Zellmembran verschmelzen können, da beide aus einer Phospholipid-Doppelschicht bestehen. ^[14] Bei der Lipofektion wird im Allgemeinen ein positiv geladenes (kationisches) Lipid (kationische Liposomen oder Mischungen) verwendet, um ein Aggregat mit dem negativ geladenen ( anionisches genetisches Material. ^[15] Diese Transfektionstechnologie erfüllt die gleichen Aufgaben wie andere biochemische Verfahren unter Verwendung von Polymeren, DEAE-Dextran, Calciumphosphat und Elektroporation. Die Wirksamkeit der Lipofektion kann durch Behandeln transfizierter Zellen mit einem milden Hitzeschock verbessert werden. ^[16]


• Fugene ist eine Reihe von häufig verwendeten proprietären nicht-liposomalen Transfektionsreagenzien, die dazu in der Lage sind Direktes Transfizieren einer Vielzahl von Zellen mit hoher Effizienz und geringer Toxizität. ^{[17][18][19][20]}

Nichtchemische Methoden [ edit ]

Elektroporator mit Wellenformen für Rechteckwellen und exponentiellem Zerfall für in vitro, in vivo , anhaftende Zellen und Elektroporationsanwendungen mit 96 Vertiefungen. Hergestellt von BTX Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA.

• Elektroporation (Gen-Elektrotransfer) ist eine beliebte Methode, bei der eine vorübergehende Erhöhung der Permeabilität der Zellmembran erreicht wird, wenn die Zellen kurzen Impulsen eines starken elektrischen Feldes ausgesetzt werden. [19659028] Cell Quetschen ist eine 2012 von Armon Sharei, Robert Langer und Klavs Jensen am MIT entwickelte Methode. Es ermöglicht die Abgabe von Molekülen in Zellen durch Zellmembrandeformation. Es ist eine vektorfreie Mikrofluidikplattform mit hohem Durchsatz für die intrazelluläre Abgabe. Es verringert die Möglichkeit von Toxizität oder Nebeneffekten, da es nicht auf exogene Materialien oder elektrische Felder angewiesen ist. ^[21]


• Sonoporation verwendet Ultraschall mit hoher Intensität, um die Porenbildung in Zellmembranen zu induzieren. Diese Porenbildung wird hauptsächlich der Kavitation von Gasblasen zugeschrieben, die mit benachbarten Zellmembranen in Wechselwirkung treten, da sie durch die Zugabe von Ultraschallkontrastmittel, einer Quelle für Kavitationskeime, verstärkt wird.


• Die optische Transfektion ist eine Methode, bei der eine winzige (~ 1 µm) Membran vorliegt Durchmesser) wird vorübergehend in der Plasmamembran einer Zelle mit einem hochfokussierten Laser erzeugt. Diese Technik wurde erstmals 1984 von Tsukakoshi et al. Beschrieben, die mit einem frequenzverdreifachten Nd: YAG eine stabile und transiente Transfektion normaler Ratten-Nierenzellen erzeugte. ^[22] Bei dieser Technik wird jeweils eine Zelle behandelt, wodurch sie entsteht besonders nützlich für die Analyse einzelner Zellen.


• Protoplastenfusion ist eine Technik, bei der transformierte Bakterienzellen mit Lysozym behandelt werden, um die Zellwand zu entfernen. Danach werden fusogene Mittel (z. B. Sendai-Virus, PEG, Elektroporation) verwendet, um den Protoplasten, der das interessierende Gen trägt, mit der Zielempfängerzelle zu fusionieren. Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode besteht darin, dass auch Bakterienkomponenten unspezifisch in die Zielzelle eingebracht werden.


• Impalefektion ist eine Methode zur Einführung von DNA, die an eine Oberfläche einer in eine Zelle eingeführten Nanofaser gebunden ist. Dieser Ansatz kann auch mit Arrays von Nanofasern implementiert werden, die in eine große Anzahl von Zellen und in intaktes Gewebe eingebracht werden.


• Die hydrodynamische Abgabe ist eine Methode, die bei Mäusen und Ratten verwendet wird, jedoch in geringerem Umfang bei größeren Tieren, bei denen die DNA am häufigsten vorkommt In Plasmiden (einschließlich Transposons) kann die Leber unter Verwendung einer hydrodynamischen Injektion abgegeben werden, die die Infusion eines relativ großen Volumens in das Blut in weniger als 10 Sekunden beinhaltet; Nahezu die gesamte DNA wird durch dieses Verfahren in der Leber exprimiert. ^[23][24][25]

Partikelbasierte Methoden [ edit ]

• Ein direkter Ansatz für die Transfektion ist die Genkanone, in der sich die DNA befindet gekoppelt an ein Nanopartikel eines inerten Feststoffs (üblicherweise Gold), der dann direkt in den Zellkern der Zielzelle "geschossen" wird.


• Magnetofection oder magnetunterstützte Transfektion ist eine Transfektionsmethode, bei der die DNA mittels Magnetkraft in das Ziel geleitet wird Zellen. Nukleinsäuren werden zuerst mit magnetischen Nanopartikeln assoziiert. Durch die Anwendung von Magnetkraft werden die Nukleinsäurepartikelkomplexe dann zu den Zielzellen hin und in diese hinein befördert, wo die Ladung freigesetzt wird. ^[26]


• Die Impalefektion wird durchgeführt, indem die Zellen durch längliche Nanostrukturen und Arrays gespalten werden solche Nanostrukturen wie Kohlenstoff-Nanofasern oder Silizium-Nanodrähte, die mit Plasmid-DNA funktionalisiert wurden.


• Eine andere partikelbasierte Transfektionsmethode ist als Partikelbeschuss bekannt. Die Nucleinsäure wird durch Membrandurchdringung mit hoher Geschwindigkeit abgegeben, normalerweise verbunden mit Mikroprojektilen. ^[2]

Andere (und Hybrid-) Methoden [ edit

Andere Methoden der Transfektion umfassen Nukleofektion, die sich bei der Transfektion der THP-1-Zelllinie als sehr effizient erwiesen hat, wodurch eine lebensfähige Zelllinie geschaffen wurde, die in reife Makrophagen differenziert werden konnte ^[27] und Hitzeschock.

Virale Methoden [ edit ]

DNA kann auch unter Verwendung von Viren als Träger in Zellen eingeführt werden. In solchen Fällen wird die Technik als virale Transduktion bezeichnet, und es wird gesagt, dass die Zellen transduziert werden. Adenovirale Vektoren können für virale Transfektionsverfahren nützlich sein, da sie Gene in eine Vielzahl von menschlichen Zellen übertragen können und hohe Transferraten aufweisen. ^[2] Lentivirale und paramyxovirale Vektoren sind auch aufgrund ihrer Fähigkeit, Zellen zu transduzieren, die derzeit keine Mitose durchlaufen, hilfreich.

Stabile und transiente Transfektion [ edit ]

Stabile und transiente Transfektion unterscheiden sich in ihren Langzeitwirkungen auf eine Zelle; Eine stabil transfizierte Zelle exprimiert kontinuierlich transfizierte DNA und leitet sie an Tochterzellen weiter, während eine transient transfizierte Zelle transfizierte DNA für kurze Zeit exprimiert und nicht an Tochterzellen weitergibt.

Für einige Anwendungen der Transfektion reicht es aus, wenn das transfizierte genetische Material nur vorübergehend exprimiert wird. Da die im Transfektionsprozess eingeführte DNA in der Regel nicht in das Kerngenom integriert ist, wird die fremde DNA durch Mitose verdünnt oder abgebaut. ^[28] Zelllinien, die das Kernvirus-Antigen 1 (EBV1) von EBV1 oder das Epstein-Barr-Virus (EBNA) exprimieren SV40-Large-T-Antigen ermöglichen die episomale Amplifikation von Plasmiden, die die viralen EBV (293E) oder SV40 (293T) Replikationsursprünge enthalten, was die Verdünnungsrate stark verringert. ^[29]

Wenn gewünscht Damit das transfizierte Gen tatsächlich im Genom der Zelle und ihrer Tochterzellen verbleibt, muss eine stabile Transfektion erfolgen. Um dies zu erreichen, wird ein Markergen co-transfiziert, was der Zelle einen selektierbaren Vorteil verschafft, wie etwa die Resistenz gegenüber einem bestimmten Toxin. Einige (sehr wenige) der transfizierten Zellen haben zufällig das fremde genetische Material in ihr Genom integriert. Wenn das Toxin dann der Zellkultur zugesetzt wird, können sich nur wenige Zellen mit dem in ihre Genome integrierten Markergen vermehren, während andere Zellen absterben. Nach Anwendung dieses selektiven Streßes (Selektionsdruck) für einige Zeit verbleiben nur die Zellen mit einer stabilen Transfektion und können weiter kultiviert werden. ^[30]

Übliche Mittel zur Auswahl einer stabilen Transfektion sind:

RNA-Transfektion [ edit ]

RNA kann auch in Zellen transfiziert werden, um das kodierte Protein vorübergehend zu exprimieren oder die Kinetik der RNA-Abklärungen zu untersuchen. RNA-Transfektion wird häufig in Primärzellen verwendet, die sich nicht teilen.

siRNAs können auch transfiziert werden, um RNA-Silencing zu erreichen (d. H. Verlust von RNA und Protein aus dem Zielgen). Dies ist zu einer Hauptanwendung in der Forschung geworden, um einen "Knock-Down" von interessierenden Proteinen (z. B. Endothelin-1 ^[31]) mit potentiellen Anwendungen in der Gentherapie zu erreichen. Einschränkung des Silencing-Ansatzes ist die Toxizität der Transfektion für Zellen und mögliche "off-target" -Effekte auf die Expression anderer Gene / Proteine.

Siehe auch [ edit ]

Referenzen [ edit

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Weiterführende Literatur [ edit ]

Externe Links [ edit